RiboNup

Contexte

La tumorigenèse s’accompagne à l’échelle cellulaire d’altérations génétiques et épigénétiques. Un exemple de modification épigénétique est la méthylation des ARN ribosomiques (ARNr). Il a en effet été démontré une altération du profil de méthylation des ARNr dans les cellules cancéreuses, modification pouvant favoriser dans certains cas la traduction d’ARNm d’oncoprotéines. La biogenèse des ribosomes s’effectue essentiellement dans le noyau au sein du nucléole. Les sous-unités sont ensuite exportées au travers du pore nucléaire jusque dans le cytoplasme où ont lieu les dernières étapes de leur maturation. En plus d’avoir un impact sur la fonction des ribosomes, les modifications qui ont lieu pendant leur biogenèse, comme la méthylation des ARNr par exemple, contribuent à la flexibilité des ARN ribosomiques et pourraient donc avoir un effet sur leur transport à travers le pore nucléaire.

Objectifs

Le but du projet est d’explorer les aspects concernant la dynamique de transport et de mobilité des ribosomes. Il s’agit ici d’évaluer l’impact sur le transport de la composition des ribosomes, soit en fonction de la méthylation des ribosomes soit en fonction du stade tumoral des cellules dont les ribosomes sont issus. Le projet se divise en deux axes : le premier concerne plus précisément le transport des ribosomes, suivi par microscopie Zero-Mode Waveguide. Le deuxième se focalise sur des approches in cellulo, par suivi en microscopie confocale par FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) de la mobilité des ribosomes qui permettra de déterminer leur transport nucléo-cytoplasmique.

Méthodologie

Pour les deux axes de recherche : des lignées de cellules cancéreuses mammaires, les MDA-MB-231 et des cellules MDA-MB-231 exprimant chacune une protéine fluorescente (GFP) d’une des deux sous-unités du ribosome ont été produites. De la doxycycline a été utilisée pour induire dans ces cellules la production d’un shRNA ciblant la fibrillarine, la méthyltransférase responsable de la méthylation des ARNr. Les ribosomes ont été extraits puis marqués par fluorescence. Ils ont ensuite été soumis à différentes pressions permettant leur passage au travers une membrane perforée de pores de diamètre donné mimant le pore nucléaire. Les particules marquées par fluorescence ont été détectées au microscope et comparées entre des cellules où la méthylation des ARNr a été réduite et des cellules contrôle. Les cellules exprimant la protéine ribosomique, RPS2-GFP ou RPL29-GFP ont été utilisées pour suivre la mobilité des protéines par photoblanchiment.

Résultats

Concernant le transport des sous-unités ribosomiques au travers d’un modèle de membrane nucléaire, les ribosomes ont tendance à s’agréger spontanément avec une différence de passage entre les ribosomes extraits de cellules où la méthylation des ARNr a été réduite et ceux de cellules contrôle. De plus, il a été montré que la méthylation semble affecter les propriétés de transport des sous-unités ribosomiques. Concernant la mobilité de sous-unités ribosomiques in cellulo, pour les cellules exprimant RPS2-GFP, le calcul de la fraction de protéines immobiles a révélé seulement 5 à 10% des protéines fluorescentes immobiles en utilisant de la puromycine contre 25 à 30 % sans puromycine. Ces tests montrent donc que la fraction immobile est liée à l'activité de traduction, et indiquent que les ribosomes en cours de traduction sont peu ou pas mobiles. Ce projet a permis de fournir des indications le degré de méthylation des ARNr qui pourrait influencer le transport des sous-unités ribosomiques in vivo. De plus, la vitesse de diffusion d’une sous-unité ribosomique dans le cytoplasme peut être de plusieurs micromètres par seconde.

Valorisation

Heudel P, Frenel JS, Dalban C, Bazan F, Joly F, Arnaud A, Abdeddaim C, Chevalier A, Augereau P, Pautier P, Chakiba C, You B, Lancry Lecomte L, Garin G, Marcel V, Diaz JJ, Treilleux I, Pérol D, Fabbro M, Ray-Coquard I. Victoria: A multicentric, randomized, open-label, phase I/II of mTOR inhibitor (VISTUSERTIB) combined with anastrozole in patients with hormone receptor-positive advanced/metastatic endometrial cancer—A CLIPP program INCA in collaboration with GINECO group. Jama Oncol In Press (2022)

Morin C, Moyret-Lalle C, Mertani HC, Diaz JJ & Marcel V. Heterogeneity and dynamic of EMT through the plasticity of ribosome and mRNA translation. BBA - Reviews on Cancer. In Press (2022) Therizols G, Bash-Imam Z, Panthu B, Machon C, Vincent A, Ripoll J, Nait-Slimane S, Chalabi-Dchar M, Gaucherot A, Garcia M, Lafôrets F, Marcel V, Boubaker-Vitre J, Monet MA, Bouclier C, Vanbelle C, Souahlia G, Berthel E, Albaret MA, Mertani HC, Prudhomme M, Bertrand M, David A, Saurin JC, Bouvet P, Rivals E, Ohlmann T, Guitton J, Dalla-Venezia N, Pannequin J, Catez F* and Diaz JJ*. Alteration of ribosome function upon 5-fluorouracil treatment favors cancer cell drug-tolerance. Nat Commun 13, issue 1, 173 (2022)